Peter Parker (Tobey Maguire) ha comenzado a sentirse seguro en su vida (su trabajo es estable, sus estudios progresan y la gente de New York ve con mejores ojos a Spider-Man) y tiene la intención de proponerle matrimonio a Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), que acaba de hacer su debut musical en Broadway. Mientras Peter y Mary Jane están en su cita, un pequeño meteoritose estrella cerca, y un simbionte extraterrestre se pega al ciclomotor de Peter. Mientras tanto, el convicto fugitivo Flint Marko(Thomas Haden Church) cae accidentalmente en un pozo de un acelerador de partículas que fusiona su cuerpo con la arena circundante. El resultado le permite cambiar de forma a voluntad, convirtiéndose en el Hombre de Arena. El mejor amigo de Peter,Harry Osborn (James Franco), que busca venganza por la muerte de su padre, que él cree que Spider-Man causó, lo ataca con armas nuevas adaptadas de la tecnología del Duende Verde que su padre había dejado atrás. Durante la pelea, Harry se lesiona la cabeza y sufre de amnesia parcial, haciéndole olvidar su enemistad y el hecho de que Peter es Spider-Man.
Más tarde, durante un festival en honor a Spider-Man por salvar la vida de Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard), Sandman intenta robar un furgón blindado, y derrota a Spider-Man. El Capitán de la Policía de Nueva York George Stacy (James Cromwell), el padre de Gwen, más tarde, le informa a Peter y a su tía May (Rosemary Harris) que el asesino de Ben Parker era en realidad Flint Marko, y que el ya fallecido asaltante no era más que un cómplice. Un vengativo Peter espera que Marko ataque de nuevo. El simbionte se une con su traje mientras él está dormido; Peter despierta colgado de un rascacielos en el centro de Manhattan y descubre que no sólo ha cambiado su traje, también sus poderes han mejorado. Tal vez la capitalización del actual conflicto de Peter y el estado angustiado de la mente, el traje negro saca a relucir el lado más vengativo, egoísta y arrogante de la personalidad de Peter. Usando el nuevo traje, Peter localiza a Marko, lucha contra él en un cavernoso túnel subterráneo del metro y, al descubrir que el agua puede disolver el cuerpo de Marko, rompe una tubería de agua grande para enviar lo que él cree que es un torrente letal de agua, convirtiendo al Hombre de Arena en barro. Con ello, Peter cree haber matado a Marko y al decirle a la tía May sobre la presunta muerte de Marko a manos de Spiderman, que si bien para Peter fue como vengar a su tío, ella le advierte que la venganza además de ser mala lo envenenaría.
El cambio en la personalidad de Peter aleja a Mary Jane, cuya carrera empieza a tambalearse ya que fue despedida de Broadway y consigue empleo en un bar como camarera y cantante. Mientras, ella encuentra consuelo con Harry. Harry se recupera de su amnesia y, empujado por una aparición de su padre muerto, tal y como sucedió casi al final de la segunda pelicula, obliga a Mary Jane a romper con Peter para que Harry no lo mate. Después de que Mary Jane deja a Peter, indicando que ella está enamorada de otro, Harry pasa un rato con él en un restaurante y dice ser ese otro. Más tarde, Peter que descubre que ha recuperado la memoria va y se enfrenta a él en la mansión Osborn. Con la ayuda del traje negro, Peter es el vencedor de su pelea brutal y le deja a Harry la cara desfigurada debido a una mini-explosión de una bomba. Influenciado por el traje, Peter delata y humilla a Eddie Brock(Topher Grace), un fotógrafo independiente rival, que acaba de quitarle su puesto de fotógrafo en el Daily Bugle al presentar unas fotografías falsas supuestamente de Spider-Man como un criminal. Cuando J. Jonah Jameson (J. K. Simmons) se entera de las fotos despide a Eddie. Peter cambia su forma de vestir por un atuendo negro y cambia su peinado habitual, comenzando a comportarse con demasiada arrogancia, orgullo, maldad e indiferencia. Mientras tanto, el Hombre de Arena sobrevive después de la lucha que había tenido con el Hombre Araña días antes.
Los celos de Peter, después de lo sucedido con Mary Jane, no se hacen esperar. Una noche él invita a Gwen al club de jazz donde trabaja Mary Jane de camarera. Peter arma un espectáculo utilizando al público y a Gwen, intentando poner celosa a Mary Jane, y ella reacciona decepcionada. Tras esto Peter la confronta, pero son interrumpidos por el dueño del club quien temiendo que Peter cometa algún acto violento, pide a sus guardias que lo echen del lugar. Peter enseguida reacciona eufóricamente y acorrala al guardia que intentaba sacarlo, otros guardias y clientes intentan detenerlo pero los golpea, Mary Jane también intenta detenerlo y también la golpea dejándola en el suelo. Peter, al verla tirada, reacciona nuevamente y se tranquiliza, se da cuenta de que el traje simbiótico es el causante de su ira. Él sale del club y se va al campanario de la iglesia para deshacerse de él. Al principio, él no se puede quitar el traje, pero el alienígena con el tiempo se debilita debido a los sonidos fuertes de la campana, lo que le permite a Peter liberarse. Eddie Brock, por casualidad, se encuentra en la misma iglesia rezando por la muerte de Peter, ahí mismo lo descubre y el simbionte cae de la torre y se une a su cuerpo y convierte a Eddie en Venom. Eddie encuentra al Hombre de Arena y le propone unir fuerzas para destruir a Spider-Man, a lo que el Hombre de Arena acepta.
Los dos secuestran a Mary Jane en un taxi y la cuelgan de una telaraña por encima de una gigantesca obra en construcción para atraer al Hombre Araña. Peter, convencido de que no podrá él solo contra los dos, va y le pide ayuda a Harry, pero éste, resentido por lo que Peter le hizo, se niega. En ese momento su mayordomo Bernard le cuenta la verdad acerca de la muerte de su padre, ya que la noche en que había muerto, él limpió las heridas de su cuerpo y vio que tenía clavadas las cuchillas de su propio aerodeslizador. Peter llega y se enfrenta a los dos villanos con el Hombre de Arena convertido en una encarnación gigantesca y monstruosa. Ambos están logrando acabar con él y cuando todo parece perdido, Harry llega y lo salva y juntos comienzan a pelear contra los dos villanos y rescatan a Mary Jane. Harry acaba con el ahora gigantesco Hombre de Arena y después ayuda a Peter, quien fue apresado por las manos por Venom. Éste le quita el planeador a Harry, quien cae sobre unos tubos metálicos, produciendo un ruido insoportable para el simbionte de Venom. Éste se recupera e intenta apuñalar a Peter, pero Harry se interpone (intencionalmente para sacrificarse y salvar la vida de Peter) y es mortalmente herido por las cuchillas. Peter grita desesperado por lo que estaba viendo y logra desatarse de las manos, se enfrenta a Venom haciendo ruido con los tubos (recordando que el ruido intenso debilita al simbionte) y apresándolo con los mismos. El simbionte sufre tanto dolor que libera a Brock, y Peter saca a Eddie con una telaraña. Peter lanza una de las bombas-calabaza de Harry contra el simbionte, y Eddie salta hacia la misma en un intento instintivo de reunirse con el simbionte. Ambos mueren por la explosión.
Después de la batalla, Marko se recupera y le dice a Peter que no tenía intención de matar a Ben Parker (pero disparó su arma como una reacción de angustia cuando el delincuente que Peter dejó escapar lo agarró del brazo), y que fue un accidente nacido de un intento desesperado de salvar la vida de su hija enferma. Afirma que la muerte de Ben Parker le ha perseguido durante el resto de su vida. Peter lo perdona, y el Hombre de Arena se disipa y se aleja flotando. Más tarde Peter se reúne con Mary Jane y Harry agonizando, se perdonan el uno a otro ratificando su amistad y Harry, pasando el mismo destino que su padre, muere, días después es el funeral de Harry. Otros días más tarde, Peter entra en el club de jazz donde Mary Jane trabaja y se abrazan, simbolizando el recíproco amor que se tienen después de todo.